PCR實驗室建設(shè)所需資料

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1周前

4月26日，國家衛(wèi)健委舉辦全國視頻會議，明確提出“所有縣區(qū)級以上疾控機構(gòu)、二級以上綜合醫(yī)院要抓緊進行改造，在短時間內(nèi)形成核酸檢測能力”。

各地的公立機構(gòu)檢測能力不能滿足需求只是暫時的，獨立醫(yī)學(xué)實驗室在充實檢測力量的同時，發(fā)揮自己豐富的檢驗管理運營理念，以及區(qū)域化覆蓋的經(jīng)驗優(yōu)勢，融入到“國家隊”核酸檢測能力的建設(shè)中，順勢而為，乘勢而上。

隨著各地都在建立PCR實驗室，本文從硬件基礎(chǔ)的角度，梳理了PCR實驗室建設(shè)的幾個關(guān)鍵點，獨立醫(yī)學(xué)實驗室可以運用豐富的運營經(jīng)驗，進行建設(shè)指導(dǎo)、人員梯隊建立、質(zhì)控體系搭建、區(qū)域化服務(wù)支持等。

如何建設(shè)PCR實驗室

與PCR實驗室建設(shè)相關(guān)的指導(dǎo)文件主要有四份：

《醫(yī)療機構(gòu)管理條例》

《醫(yī)療機構(gòu)臨床實驗室管理辦法》

《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》

《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》

要求臨床PCR實驗室，不但在實驗室設(shè)置及儀器設(shè)備等硬件上要滿足開展臨床檢驗的條件，而且要求實驗室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR實驗室建設(shè)過程中的幾個關(guān)鍵控制點進行闡述:

01

建立PCR實驗室質(zhì)量管理體系

根據(jù)實驗室的具體情況編寫質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》，并保證管理體系運行有效。

管理體系的特點是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機制、能自我發(fā)展的整體。

建立完善的SOP文件，對完成各項質(zhì)量活動的方法作出規(guī)定，每個SOP都應(yīng)對一個或一組相互關(guān)系的活動進行描述。

每個SOP文件應(yīng)說明該項質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動的接口關(guān)系。

明確每個環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)。

規(guī)定在質(zhì)量活動中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴格遵守。

02

PCR實驗室的相關(guān)設(shè)置

要完成一組PCR實驗，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增和產(chǎn)物分析4個實驗過程。

這4個實驗過程的實驗用房應(yīng)相鄰布置，組成一個獨立的PCR實驗區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實驗區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。

PCR實驗室整體平面布局

某醫(yī)院PCR實驗室平面布局如圖1所示，整個區(qū)域有一個公用走廊，每個獨立實驗區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

圖表1、某醫(yī)院PCR實驗室平面圖

試劑準(zhǔn)備區(qū)

該實驗區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染。

標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。

標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計算冷負荷時，需要將它們計算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實驗室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器(www.gdlingjie.net)過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實驗室中。

根據(jù)經(jīng)驗，如果實驗室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺，實驗室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為正壓，以避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。

擴增室

該區(qū)域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。

在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。

擴增室主要配備PCR實驗室的核心儀器PCR儀，本文實例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實驗室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用全自動封閉分析儀器檢測，此區(qū)域可不設(shè)。

在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對負壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m²~20m²。

本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對于鄰近區(qū)域為負壓，以避免擴增產(chǎn)物從本區(qū)擴散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實現(xiàn)。

03

正負壓區(qū)域緩沖室的設(shè)置

根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對正壓，擴增室和產(chǎn)物分析室為相對負壓，要求正壓的區(qū)域和要求負壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設(shè)計大不相同。

正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進入室內(nèi)。正壓緩沖室的布置如圖2所示。

圖表2、正壓緩沖室的布置圖

負壓緩沖室則是要求緩沖室對核酸擴增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。負壓緩沖室的布置如圖3所示。

圖表3、負壓緩沖室的布置圖

04